地中海贫血基因诊断与遗传咨询
邢晓为 李麓芸 傅俊江 钟昌高 莫亚勤 范双喜 卢光 2005-12-13 13:07:20 中华中西医杂志 2003年8月第4卷第15期
【摘要】 目的 研究就诊病人中地中海贫血患者的基因突变类型，为更好地开展地中海贫血的产前诊断和遗传咨询工作奠定基础。方法 应用PCR技术对9例α地中海贫血患者及1例风险胎儿进行缺失检测;应用等位基因扩增突变不应系统（amplification refractory mutation system，ARMS）技术对25个β地中海贫血家系（其中22例产前诊断）及7例散发病例的β珠蛋白基因nt-28（A→G）、CD17（A→T）、CD41-42（-CTTT）、CD71-72（+A）、IVS-2nt654（C→T）进行检测。结果α地贫10例标本中9例检测到了大片段缺失。β地贫中，nt-28（A→G）2例，CD17（A→T）11例，CD41-42（-CTTT）21例，CD71-72（+A）0例，IVS-2nt654（C→T）23例。结论 在就诊患者中，β地贫主要以点突变为主，其中有三个突变热点，分别为CD41-42（-CTTT）、IVS-2nt654、CD17（A→T）。α地贫的基因改变主要是以大片段缺失为主。该研究将有助于开展地中海贫血病的遗传咨询工作，为进行产前诊断和遗传优生工作奠定基础。
关键词 地中海贫血 基因诊断 产前诊断 等位基因扩增突变不应系统 遗传咨询
Gene diagnosis and genetic consulting for thalassemia
Xing Xiaowei，Li Luyun，Fu Junjiang，et al.
Institute of Reproduction and Stem Cellular Engineering，Central South University，Changsha410078.
【Abstract】 Objective To get a good basis for prenatal gene diagnosis andgenetic consulting for thalassemia，mutant types were investigated in our hospital.Methods Using primer pairs AB and AC，PCR were performed to deˉtect the delete ofα-globulin gene among9patients and a fetus at risk;The amplification refractory mutation system was performed to investigate5frequently mutant loci knowninβ-globulin gene among59patients and22fetus who was suspected a high risk ofβ-thalassemia.Results Inα-thalassemia，9of10were found the delete inα-globuˉlin gene;Inβ-thalassemia，mutant were found as following:nt-28（A→G）2cases，CD17（A→T）11cases，CD41-42（-CTTT）21cases，CD71-72（+A）0case，654（C→T）23cases.Conclusion Inβ-thalassemia，3hot mutant loci were found，which were CD41-42（-CTTT），IVS-2nt654，CD17（A→T）.Inα-thalassemia，the major mutant type is delete of long fragment.The results may aid in genetic consulting of thalassemia.
Key words thalassemia gene diagnosis prenatal diagnosis ARMS genetic consulting
地中海贫血（简称地贫）是由于珠蛋白基因发生突变导致α和β类蛋白肽链表达失衡而产生的一类遗传性血液病，也是世界范围内最为常见的一类单基因遗传病，其中以α、β地贫最为常见［1］。该遗传病不仅严重影响患者的身体，同时也给患者家庭和社会带来了严重的经济负担。曾瑞萍等［2］对广东人群研究表明，人群中α地贫杂合子的检出率为8.3%，β地贫为2.6%，α与β双重杂合子也占一定比例。湖南省尚未见这方面的报道。为了减少这类遗传病的发病率，本医院从1998年4月开始开展了该病的遗传咨询门诊，对患者及其家属进行了有效的基因诊断和产前诊断并提供遗传咨询，现将诊断结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象 1998年4月～2003年4月间来我院遗传咨询门诊就诊的地贫患者，风险胎儿以及有地贫家族史的育龄夫妇。
1.2 实验材料 Taq DNA聚合酶、dNTP以及电泳检测等试 ˇ 基金项目:国家重点基础研究发展规划（973）资助项目（No.G1999055901） 剂均购自上海生物工程公司;引物由上海生物工程公司合成;DNA分离试剂盒购自Gentra公司。
1.3 研究方法
1.3.1 标本DNA的抽提 地贫患者与携带者各抽取5ml静脉血，风险胎儿在B超监视下经羊膜腔穿刺，抽取羊水10ml或脐带血2～3ml。DNA抽提按照DNA分离试剂盒方法进行。
1.3.2 PCR扩增
1.3.2.1α地贫的PCR扩增［3，4］设计正常引物对AB及跨越断裂点引物对AC［3，4］，对9例α地中海贫血患者、1例风险胎儿及45例β地中海贫血携带者的α珠蛋白基因进行缺失检测，PCR反应条件如下:在20μl的反应总体系中加入下列物质:双蒸水12μl，10×PCR反应缓冲液2μl，2mmol/L dNTP2μl，25mmol/L MgSO 41.6μl，Taq DNA聚合酶0.4μl，10mmol/L的引物对0.6μl，gDNA1.4μl。在PE9600型PCR扩增仪上完成PCR扩增，条件如下:95℃预变性2min后，95℃变性25s，64℃退火25s，72℃延伸25s，完成35个循环，最后72℃延伸5min，置4℃保温，4μl PCR反应产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色、照相。
1.3.2.2β地贫的PCR扩增［5］应用ARMS技术对患者β珠蛋白基因nt-28（A→G）、CD17（A→T）、CD41-42（-CTTT）、CD71-72（+A）、IVS-2nt654（C→T）进行检测。正常及突变引物的设计以及PCR反应条件参照文献［5］进行。
2 结果
2.1α地贫
2.1.1α地贫基因诊断和产前诊断结果 所检测的9例α地贫患者中，有8例为典型的东南亚型α地贫Ⅰ型患者。正常引物AB扩增出了331bp的特异性条带，说明患者至少还有一个正常的α珠蛋白基因;跨越断裂点的AC引物扩增出195bp的特异性条带，说明患者至少有一个α珠蛋白基因出现了大片段缺失。1例α地贫风险胎儿产前诊断结果发现，该胎儿正常引物AB扩增出了331bp的片段，但缺失引物AC也扩增出了195bp的特异性条带（见图1）。羊水与脐血检测的结果一致。我们诊断该风险胎儿为东南亚型α地贫Ⅰ型患者。图1 应用AC引物PCR扩增α地贫风险胎儿结果1、2为正常人，AC引物扩增无产物;3患儿父亲;4患儿;5患儿母亲;6胎儿脐带血标本;M Maker
2.1.2α地贫遗传咨询 东南亚型α地贫Ⅰ型患者由于所缺失的α珠蛋白个数不同，在临床上呈现很强的临床异质性。有的患者症状很轻微，甚至没有临床表现，但是有的患者
