国人常见的两种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变及其临床表现

　　探讨中国人中两种常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因突变与临床表现的关系。方法　应用突变扩增系统（ARMS）法，研究15例云南籍汉族G6PD缺乏症患儿两种常见G6PD基因突变，并对其临床表现进行分析。结果　15例中检出 cDNA G1388A突变9例，cDNA G1376T突变5例，未定型1例。所有患者都具有急性溶血性贫血，黄疸等临床表现及不同程度的血红蛋白尿、G6PD酶活性降低。结论　G6PD基因cDNA G1376T和 cDNA G1388A突变时具有相似的临床表现。

　　遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症的基础研究已深入到分子水平。至1997年，全世界所报道的G6PD基因突变为122种以上，其中大多为点突变［1］。中国人中已报道的G6PD基因突变为14种，都为点突变，其中cDNA1388（G→A）（G1388A）和cDNA 1376（G→T）（G1376T）突变占50%以上［2］，为中国人中最常见的G6PD基因突变类型。G6PD基因的各种突变所致的G6PD缺乏症具遗传异质性，临床表现呈个体差异。为探讨G6PD基因突变与临床表现的关系，我们通过突变扩增系统（amplification refractary mutation system，ARMS）方法检测云南省汉族G6PD缺乏症患儿cDNA1388（G→A）和cDNA1376（G→T）这两种中国人中最常见的突变，并对其临床表现进行分析。病例来源：15例G6PD缺乏症患儿均为男性，均为昆明医学院第二附属医院住院患儿，父系及母系三代居住云南，相互间无亲缘关系。发病诱因都是在蚕豆成熟季节进食蚕豆而发病，通过静脉血紫外分光光度计定量测定G6PD活性确定为G6PD缺乏症。临床实验室检查：（1）确定贫血程度［3］；（2）根据急性溶血的临床体征和既往史进行有关溶血的实验室检查，以排除其他因素所致的溶血。（3）G6PD活性测定，酶活性单位以每克Hb含多少国际单位来表示（IU/g），正常值为4～7 IU/g。基因检测：DNA制备：按常规法，蛋白酶K消化，酚∶ ∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。PCR引物设计：ARMS法试剂盒由中山医科大学遗传研究室提供。引物序列为：上游引物1388L2：5′GACCTGACCTACGGCAACAGATAC3′下游引物1388M2：5′GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT3′，1376M：5′TGAAAATACGCCAGGCCTCAA 3′，1388L2和1388M2特异性扩增G6PD基因第12外显子cDNA1388（G→A）突变，扩增出361bp片段，而1388L2和1376M扩增cDNA1376（G→T）突变，扩增出345bp片段。基因扩增：30 μl聚合酶链反应含基因组DNA 1.0 μg，10×反应缓冲液3.0 μl，dNTPs（2 mmol/L）3.0 μl，5′上游引物和3′下游引物各20 ng，内对照引物40 ng。反应条件为97℃变性7分钟，在85℃下加1.5U GD Taq酶后，进入热循环。循环条件为：94℃30秒，59℃45秒，72℃50秒，共25个循环，72℃继续保温7分钟。PCR在自动PCR仪（英国HYADI公司Omn-E）中进行。结果观察：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，选用1 kb λDNA作为DNA分子量标准。银染，固定，干燥保存。

　　结果，患儿临床表现，本组15例G6PD缺乏症患儿均表现为急性进行性贫血、黄疸，发热5例，占33%。基因检测结果，15例患儿中，G1376T突变者5例（图1），G1388A突变者9例（图2），未定型1例。显示G1388A和G1376T突变为云南省汉族G6PD缺乏症患儿基因突变的主要类型。临床实验室检测结果，14例已知基因型的G6PD缺乏症患儿中轻度贫血3例（21%）；中度贫血4例（29%）；重度贫血6例（43%）；极重度贫血1例（7%）；尿潜血试验阳性11例（79%）；14例患儿Hb电泳全部正常，除外了Hb异常所致的溶血性贫血（表1）。

　　G6PD是参与磷酸戊糖旁路代谢产生还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的关键酶。因G6PD基因突变引起的G6PD缺乏症是最常见的遗传病之一，其遗传方式为X连锁不完全显性遗传，女性杂合子表现度有很大差别，从表型正常到G6PD缺乏，因此人群中多见男性患儿。G6PD缺乏症具遗传异质性，各种点突变所致的表型变化范围宽广，临床表现从无症状到新生儿黄疸、药物诱导性溶血、蚕豆病，非球形细胞溶血性贫血（CNHSA）等。 G6PD基因含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。G6PD cDNA1388、cDNA1376同属第12外显子，相距仅12个核苷酸，其突变在华人和华裔中有较高的发生频率。突变结果使459和463位的精氨酸分别被亮氨酸和组氨酸替代。据文献报道，导致严重临床症状的突变，大都位于G6PD结合区域或NADP结合区附近， G6PD缺乏症的严重程度与靠近NADP结合位点的突变有关，轻微的缺乏是由于突变位于决定G6PD末端的氨基酸所致［4，5］。459及463位精氨酸座落在10多个具高度保守的氨基酸区域中，其位置与NADP第一结合位点386～387位氨基酸在空间位置上相距很近，在酶与NADP的结合过程中起重要作用。但G1376T是一个较保守的氨基酸替换（Arg-Leu），预期它对G6PD酶活性的影响比较大［6］。G1376T突变总是伴随着脱氨NADP利用率的显著增高，而G1388A突变并不如此［7］。台湾学者在34例需要输血治疗的新生儿G6PD缺乏症患儿中发现G1376T突变占64.7%，发生新生儿高胆红素血症的G6PD缺乏症患儿G1376T突变占多数，提示有1376突变的患儿临床症状严重［8］。本组所有病例发病原因均因进食蚕豆引起，都具急性溶血表现，如进行性贫血，黄疸及不同程度的血红蛋白尿，患儿G6PD活性均低于正常， Hb电泳排除异常血红蛋白所致的溶血性贫血。本组15例G6PD缺乏症患儿经基因检测，9例为G1388A突变，5例为G1376T突变。另1例患儿非上述两种突变，经同法ARMS检测，已排除A95G突变，其突变类型尚待确定。在这些患儿中检出的这两种突变是中国人中最常见的两种G6PD基因突变类型，表明突变具民族和地域性。所有这些患儿在发病后症状都较严重，临床表现严重程度与这两种G6PD基因突变型类型无关。发病原因与血型无关。患儿大多数经维持水、电解质平衡，碱化尿液等对症治疗即康复，仅部份患儿需要输血并合用肾上腺皮质激素治疗，患儿是否需要输血治疗由发病时贫血的严重程度决定。本组患儿G6PD基因G1376T和G1388A突变所致的临床表现没有明显区别，与谢建生等从前的报道一致。