干血纸片法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型的检测

　　为了解广东人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的基因突变型。探讨干血纸片法用于基因突变型诊断的效果。方法　采用专用滤纸干血斑，运用5对特异性引物进行DNA直接扩增、结合限制性内切酶分析技术对87例G-6-PD缺陷的住院患儿进行检测。结果　87例患儿中30例（35%）为G1376T，28例（32%）为G1388A，6例（7%）为A95G，1例（1%）为G392T，未检出C1024T，尚有22例未能定型。结论　G1376T、G1388A是广东人最常见的G-6-PD突变型。对急性溶血患儿，高铁血红蛋白还原率和G-6-PD酶活性（NBT法）假阴性时，干血纸片法可提高检出率。滤纸干血斑标本采集容易，直接进行DNA扩增，方法简单，准确度高，值得在基因研究和临床诊断中应用推广。

　　目前国内对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G-6-PD）基因突变型的检测方法有寡核苷酸探针斑点杂交技术，PCR产物DNA单链构象多态技术、等位基因特异性扩增和内切酶分析法等。而干血纸片法检测只用于新生儿筛查［1］。我们运用5种特异性引物，采用滤纸干血斑直接DNA扩增结合内切酶分析技术，对87例G-6-PD缺陷症引起急性溶血的患儿进行了检测。87例均为我院1993～1997年因急性溶血性贫血发作而住院的患儿，其中男性76人，女性11人，年龄从1个半月～10岁7个月，经临床症状和高铁血红蛋白还原率或G-6-PD酶活性测定（NBT法）确诊为G-6-PD缺陷症［2］，相互间无亲缘关系，广东籍人。标本采集：采患儿手指尖血，直接滴在新生儿筛查用滤纸（S%26S）上，形成约1 cm直径的血斑，每个患儿取6个血斑备用，待血斑自然干燥后用塑料袋装好，放-20℃冰箱内保存（滤纸由台北荣民总医院医学研究部萧广仁博士提供）。引物及限制性内切酶：针对5种不同的点突变所设计的5对特异性引物：G1376T，G1388A，A95G，G392T，C1024T（序列从略［3,4］，由萧广仁博士提供），及相应的5种内切酶：BfrⅠ，NdeⅠ，MluⅠ，BanⅠ，MboⅡ（均为美国Promega公司产品）。聚合酶链反应：取直径3 mm的滤纸干血斑，先经甲醇∶ （1∶1）混合液处理，置60℃烤箱8～10 min待溶剂挥发，然后加入PCR反应所需的各种试剂（TaqDNA聚合酶除外），95℃水浴10 min，60℃水浴20 min，最后加入TaqDNA聚合酶进行PCR循环，反应总体积30 μl。各组分的终浓度为：dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.2 mmol/L, MgCl2：2 mmol/L,上下游引物各0.2 μmol/L,1× 缓冲液（TaqDNA聚合酶厂家提供），1U TaqDNA聚合酶（Promega公司产品）。PCR反应在DNA扩增仪（Hema 480）上自动进行：95℃、1 min，59℃、1 min，74℃、30 s，1个循环；95℃、1 min，58℃、1 min，74℃、30 s，1个循环；95℃、30 s，58℃、50 s，74℃、30 s，33个循环；最后74℃延伸5 min。结果观察：取PCR产物5 μl与1 μl上样液混合，2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。限制性内切酶分析：取PCR产物5 μl，用相应的内切酶4 U 及相应缓冲液，总体积20 μl，在酗37℃消化过夜，消化产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后置紫外灯下观察结果。结果在检测的87例患儿滤纸干血斑中，有65例（75%）分别属于下列4种不同的基因突变型：G1376T，G1388A，A95G，G392T，未发现C1024T,有22例（25%）尚未能定型。患儿高铁血红蛋白还原率或G-6-PD酶活性（NBT法）的检测情况，本组7例因药物或进食蚕豆诱发急性溶血，临床诊断为 G-6-PD缺陷的患儿中，2例高铁血红蛋白还原率正常，G-6-PD酶活性（NBT法）低下；1例高铁血红蛋白还原率低下，G-6-PD酶活性（NBT法）正常，经检测证实均属G1376T突变型。另4例高铁血红蛋白还原率和G-6-PD酶活性（NBT法）均正常，分别为G1376T 2 例，G1388A和A95G各1例。C392T突变型酶切结果，我们采用滤纸干血斑直接DNA扩增，限制性内切酶分析法是根据点突变性质［3，4］应用了不完全配对的PCR引物，扩增反应后使其形成一个新的内切酶位点和一个内质控切点，经相应的内切酶切割后，形成与正常的PCR产物被切割后不同的片段（图1）。

　　本组结果表明：87例G-6-PD缺陷患儿中，分别属于4种突变型的有65例，未定型有22例，可能是其他的突变型不在本组检测范围，因此我们认为此法亦适合用于G-6-PD缺陷引起急性溶血的患儿。本组中C1376T占35%，G1388A占32%,两种共占67%,与杜传书、谢建生、何永蜀等［5-7］学者用不同的方法在不同的地区检出的52.8%、62%和68%，台湾人中占71.3%的结果基本相同［3］，都超过半数以上。也说明这两种基因突变型是中国人G-6-PD缺陷的主要突变型。本组未发现C1024T,据报道其发生率是1.8%和5.6%［1，5］，提示可能G-6-PD基因突变点不同，其诱发溶血因素可能也不同，前两种突变型易发生溶血，而后者却少见。G392T突变型酶切分析电泳图谱，从本组结果可看出，在临床发生急性溶血的病例，如实验室检查高铁血红蛋白还原率和G-6-PD酶活性（NBT法）出现假阴性，或两种方法检查结果不一致而不能确诊时，运用此法进行DNA检测，可提高G-6-PD缺陷症的检出率。用滤纸干血斑直接进行DNA扩增的优点是：采集标本容易，无需抽血，仅用指尖几滴血，用血量少，可在不同的时间收集标本储藏起来，在适当的时候进行检测。滤纸干血斑标本运输极为方便，操作时无需DNA抽提的繁锁步骤，避免了交叉污染。适用于大量的普查工作。滤纸干血斑标本直接DNA扩增，结合内切酶分析法具有方法简单易掌握，准确性好，灵敏度高，结果易判断，值得在基因研究和临床诊断方面应用和推广。